Pochodziła z arystokratycznej rodziny zamieszkałej w Padwie. Chrzest przyjęła z rąk pierwszego biskupa Padwy – Prosdocyma. Od wczesnej młodości chciała należeć tylko do Chrystusa i złożyła prywatny ślub czystości. Jej życie było nieustannym świadectwem miłości do Jezusa.

Kiedy wybuchło prześladowanie chrześcijan za cesarza Dioklecjana, została pojmana i zaprowadzona przed namiestnika Maksymiana Galeriusza, który równocześnie sprawował najwyższą władzę sądowniczą w prowincji Włoch. Podczas procesu nakazano jej wyrzec się wiary w Jezusa. Justyna jednak z odwagą odmówiła. Została skazana na śmierć przez ścięcie mieczem. Karę wykonano 7 października 304 r. Według legendy, miał to być miecz dopiero co wykuty, jeszcze gorący, co dodatkowo miało upokorzyć dziewczynę, ponieważ takimi mieczami zabijano niewolników jako pierwsze ofiary. Po śmierci Justynę pochowano w pobliżu rzymskiego teatru, we wschodniej części miasta.